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% Page de titre:
\title[\emoji{dna} Identification de variants de structure par NGS capture \emoji{dart}]
{\emoji{dna} Identification de variants de structure par NGS capture \emoji{dart}}


\author{Dr. Thomas Steimlé}
\institute[OH]{
  Laboratoire d'oncohématologie de l'hôpital Necker\\
  \vfill
  \begin{figure}[!b]
    \centering
    \includegraphics[height=1cm]{Images/1200aphp.pdf}\hspace*{5.5cm}~
    \includegraphics[height=1.5cm]{Images/necker.pdf}
  \end{figure}
}
\date{Février 2022}


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\begin{document}

\begin{frame}
\maketitle
\thispagestyle{empty}


\end{frame}
%\frame{\titlepage}
%\logo{}

% \begin{frame}
% 	\frametitle{Sommaire}
%   \setcounter{tocdepth}{1}
% 	\tableofcontents
% \end{frame}

\section{Introduction}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{question} Introduction : Hypothèses}
  \begin{itemize}
    \item[\emoji{floppy-disk}] Il est possible de détecter des altérations de 
    la structure du génome par une analyse informatique des \textit{reads} séquencés en NGS capture.
    % \item<2-> \emoji{camera-flash} Il est connu que \alert{$\approx$ 15-20 \% des LAL-T} ont une translocation impliquants le locus \textit{TRA-D}.
    \item[\emoji{dna}] Il existe probablement sur un grand nombre de cas de nouveaux \textbf{\alert{variants de structure}}
    jusqu'alors inconnus. Ces altérations pouraient imliquer de nouveaux oncogènes.
  \end{itemize}
  \vfill
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Introduction : rationnel LAL-T}
  Les translocations impliquants le locus \textit{TRA-D} sont observées dans \alert{$\approx$ 15-20 \% des LAL-T}. Avec pour partenaires principaux:
  \begin{itemize}
    \item \textit{TLX1} t(10;14)(q24;q11)
    \item \textit{TAL1} t(1;14)(p33;q11)
    \item \textit{LMO1} t(11;14)(p15;q11) 
    \item \textit{LMO2} t(11;14)(p13;q11)
  \end{itemize}
    \begin{center}  
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/translocation_10_14.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
  
  \blfootnote{Bergeron J, et al. Blood. 2007 Oct 1;110(7):2324-30.2007 Jul 3. PMID: 17609427.}
  \blfootnote{Dik WA, et al. Blood. 2007 Jul 1;110(1):388-92. PMID: 17360939.}
\end{frame}

\section{\emoji{floppy-disk} Méthodes}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{dart} Positions des sondes de capture sur le locus delta}
  Les sondes de captures ont été choisies pour être complémentaires du locus \textit{TRD} D et J (exons et introns).
  \begin{center}
    \begin{figure}
      \includegraphics[width=\textwidth]{Images/Alpha-delta-locus.png}
    \end{figure}
    \vspace*{5mm}
    \begin{figure}
      \centering
      \includegraphics[width=\textwidth]{Images/Probes_TRD.png}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{tornado} Méthode: préparation de l'ADN pour séquençage}
  1) \alert{Fragmentation mécanique} de l'ADN total extrait de prélèvement sanguins infiltrés (diagnostic).
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/fragmentation.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{magnet} Préparation de l'ADN pour séquençage}
  2) \alert{Hybridation} des sondes et \alert{capture/isolement} magnétique des fragments hybridés.
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/selection.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
  \vfill
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{desktop-computer} Analyse bioinformatique }
  3) \alert{Séquençage} (paired-end 2x 150) des fragments puis \alert{alignement} (bwa mem) des reads (R1/R2) sur le génome de référence (hg19).
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/alignement.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{desktop-computer} Analyse bioinformatique}
  4) \alert{Détection} des positions ou les reads sont mal-alignés (supplementary alignments ou insert size anormale), isolement en cluster locaux de ces reads.\\
  5) \alert{Assemblage} des reads anormaux (graph avec vertices les reads et edges les overlaps) pour obtenir une \alert{séquence consensus} qui est alignée (bwa mem) sur le génome de référence afin d'identifier les partenaires et le point de cassure.
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/assemblage.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\section{\emoji{abacus} Résultats Préliminaires}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{check-mark-button} Série de validation}
  Comparaison des résultats de différents \textit{callers} sur série de validation (N = 264) avec comme \alert{\textit{gold standard} la sonde FISH break apart \textit{TRAD}} :
  \begin{center}
    \begin{tabular}{llcc}
      & & \multicolumn{2}{c}{FISH} \\[5pt]
      \cline{3-4}
      \begin{minipage}[s][7ex][t]{0.85\textwidth}\end{minipage} & & Positive & Negative \\
      \cline{2-4} 
      \multirow{2}{*}{\rotatebox[origin=c]{90}{NGS}} \begin{minipage}[s][7ex][t]{0.85\textwidth}\end{minipage}& Positive & 43 & 4 \\[5pt]
      & Negative & 1 & 216 \\[5pt]
      \cline{2-4} \\[5pt]
    \end{tabular}
  \end{center}
  \\
  \begin{columns}
    \begin{column}{0.5\textwidth}
      Sensibilité = 98.2$\%$ \\
      Specificité = 97.7$\%$
    \end{column}
    \begin{column}{0.5\textwidth}  %%<--- here
      Valeure predictive positive = 99.5$\%$\\
      Valeure predictive negative = 91.5$\%$
    \end{column}
  \end{columns}  
  \vfill
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{check-mark-button} Comparaison avec d'autres logiciels appelants des variants de structure}
  Comparaison des résultats de différents \textit{callers} sur la série de validation (N = 264) avec toujours comme \textit{gold standard} la FISH break apart \textit{TRD} :
  \begin{center}
    \begin{tabular}{lccccccr}
      \hline
      Callers           & Se (\%) & Sp (\%) & TP & TN & FP & FN & Err \\
      \hline
      \\
      \textbf{In-house} & 98.2 & 97.7 & 43 & 216 & 4  & 1 & 0 \\ \\
      Breakdancer       & 95.2 & 97.1 & 40 & 204 & 6  & 2 & 14 \\
      Delly             & 93.2 & 95.9 & 41 & 212 & 9  & 3 & 1 \\
      Smoove            & 90.7 & 97.0 & 39 & 198 & 6  & 4 & 19 \\
      Manta             & 95.5 & 86.6 & 42 & 191 & 29 & 2 & 2 \\
      \hline
    \end{tabular}
  \end{center}
  \emoji{warning} Tous les points de cassures impliquant les nouveaux gènes ont été vérifiés par PCR, \alert{la précision de la séquence est au nucléotide près} ce qui n'est pas le cas pour les autres \textit{callers}.
\end{frame}


\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{bar-chart} Translocations impliquant le locus TRD (résultats préliminaires)}
  \begin{columns}[T]
    \begin{column}{.4\textwidth}
      \bigbreak
      LAL-T n = 1271
      \\170 TRD-oncogene (13.4\%)
      \bigbreak
      LBL-T n= 388
      \\48 TRD-oncogene (12.4\%)
      \bigbreak
      Total n= 1659
      \\218 TRD-oncogene (13.1\%)
    \end{column}
    \begin{column}{.58\textwidth}
      \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[height=.9\textheight]{Images/all_genes.png}
      \end{figure}
    \end{column}
  \end{columns}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{round-pushpin} Les translocations \textit{TRD} récurrentes}
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[height=.95\textheight]{Images/220216_BP_lolli.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{\emoji{card-file-box} Les translocations récurrentes connues: \textit{TLX1}}
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=.95\textwidth]{Images/TLX1_loli.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
  \begin{itemize}
    \item Gène homéobox NKL (HOX11) FdT qui n'est pas exprimé dans le thymus normal.
    \item Plus fréquent dans les LAL-T non-ETP et chez les adultes.
    \item altérations concomittentes: DNM2, PHF6 (43.5\%, SNV + CNV), BCL11B (SNV + CNV), MYC (nb de copies, DE MYC targets), PTPN2 ainsi que JAK-STAT ou Ras 
    \item Oncogène dont la surexpression transgénique dans la lignée T provoquerait une instabilité génétique favorisant la survenues d'autres altérations collaborantes (aneuploïdies) à la transformation (le KO dans blastes est tres apoptotique).
    \item Les translocation TRAD/TLX1: blocage au stade cortical (absence de sTCRab+) par répression de l'E$\alpha$ (coop ETS1).
  \end{itemize}

  \blfootnote{10.1126/science.1676542}
  \blfootnote{10.1038/ng.3909}
  \blfootnote{10.1038/ng.542}
  \blfootnote{10.1038/nm.2246}
  \blfootnote{10.1038/s41375-020-0938-2}
  \blfootnote{10.1016/j.ccr.2012.02.013}
\end{frame}

% \begin{frame}
%   \frametitle{\emoji{card-file-box} Les translocations récurrentes connues: \textit{LMO2}}
% \end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Altérations impliquant le locus TRD avec pour partenaire ZFP36L2}
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
        \includegraphics[width=\textwidth]{Images/ZFP36L2_lolli.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
  \begin{columns}
    \begin{column}{0.5\textwidth}
        RAG\\
        {
          \tiny
          chr2:g.pter\_43450966\_delins[chr14:g.22918104\_qterinv] \\
        }
        NER\\
        {
          \tiny
          chr2:g.pter\_43452403\_delins[CTGGCGGGACGAAAT;chr14:g.22917386\_qter] \\
          chr2:g.pter\_43453330\_delins[chr14:g.22908007\_qter]
        }\\
        IVA\\
        {
          \tiny
          chr2:g.pter\_43454037\_delins[chr14:g.22908008\_qter]
          chr2:g.pter\_43453199\_delins[G;chr14:g.22918093\_qter]
        }\\
        TAH\\
        {
          \tiny
          chr2:g.pter\_43450786\_delins[chr14:g.22918104\_qter] \\
          chr2:g.pter\_43450790\_delins[chr14:g.22908008\_qter]
        }
        \vfill  
    \end{column}
    \begin{column}{0.45\textwidth}
      \begin{figure}
        \centering 
        \includegraphics[height=0.43\textheight]{Images/gviz_stacked/TRD-ZFP36L2.pdf}
    \end{figure}
    \end{column}
    
  \end{columns}
\end{frame}

%  trim={<left> <lower> <right> <upper>}
\begin{frame}
  \frametitle{Détection de deux points de cassures sur le même gène}
  \begin{center}
    \begin{figure}
      \centering
      \includegraphics[trim={0 3 0 65}, clip, height=.7\textheight-22pt]{Images/RAG_ZFP_TREC_ZFP.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
  Alignement parfait des \textit{reads} sur le contig d'assemblage alors qu'ils étaient mal-alignés sur le génome de référence.
  \vfill
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Recombination signal sequences}
  \begin{center}
    \begin{figure}
        \centering
      \includegraphics[width=\textwidth]{Images/RSS.pdf}
    \end{figure}
    \begin{itemize}
      \item Probable \alert{Ré-insertion d'une boucle d'excision} du \textit{TRD} (D2-D3).
      \item Cependant il semble que des translocations homozygotes doivent être éliminées (long-reads).
    \end{itemize}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Confirmation par cartographie génomique optique/Bionano}
  \begin{center}
    \begin{figure}
      \centering
      \includegraphics[height=.8\textheight]{Images/ogm_all.png}
    \end{figure}
  \end{center}
  Confirmation de la ré-insertion et élimination d'un translocation homozygote.
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Alignement sur le neo-chromosome 2 pTer-ZFP36L2-TREC-ZFP36L2-centro}
  \begin{center}
    \begin{figure}
      \centering
      \includegraphics[height=\textheight-22pt]{Images/RAG_ZFP_TREC_ZFP.pdf}
    \end{figure}
  \end{center}
\end{frame}

\begin{frame}
  \frametitle{Caracteristiques des cas}
  \begin{footnotesize}
  \begin{table}
    \begin{tabular}[tl]{lcccccc}
      \toprule
      \textbf{Nom} & \textbf{Clonotype} & \textbf{NOTCH1/FBXW7} & \textbf{ETP} & \textbf{HOXA} & \textbf{Comm} & \textbf{Bionano} \\
      \midrule
      RAGOT & 2 x $\delta$D2-$\delta$D3 & Q2398* & 0 & 1 & & \checkmark \\
      TAHIR	& $\delta$D2-$\delta$D3 // GL	& P2514fs	& 1	& 1 & & \\
      NEREE	&	& FBXW7 R465H	& “immature”	& 0 & & \checkmark \\
      2080178	& $\delta$D2-$\delta$J1 // $\delta$V1-$\delta$J2	& (NRAS)	& 0	& 0 & & \checkmark \\
      HAOUZI	& $\delta$D2-$\delta$J1 // $\delta$V1-$\delta$J2	& P2443fs	& 0	& 0	& e1a2 & \checkmark \\
      JANOWSKA	&	& T1602S	&	& 0 & & \\
      IVANOV & $\delta$D2-$\delta$J1 & Couv Insuf & 0 & 0 & Diag + Rec & \checkmark \\
      \bottomrule
    \end{tabular}
  \end{table}
  \end{footnotesize}
  \begin{itemize}
    \item Clonotypes compatibles
    \item Prédominance de mutations \alert{PEST} sur la voie NOTCH1 ($\thickapprox 80\%$)
    \item TAHIR, NEREE, 208178 et HAOUZI présentent une expression \alert{hétérozygote} du transcrit (RNAseq).
  \end{itemize}
\end{frame}

\begin{frame}[t]
  \frametitle{ZFP36L2 --- Bibliographie }
    \begin{columns}[onlytextwidth,T]
      \column{\dimexpr\linewidth-30mm}
      \begin{itemize}
        \item Molécule de liaison aux ARNm (RBP) en 3' UTR.
        \item Régule l'expression en favorisant la dégradation de certains ARNm (excision de la queue polyA).
        \item \alert{dKO (L1$^{\textrm{fl}/\textrm{fl}}$L2$^{\textrm{fl}/\textrm{fl}}$ cd2-cre) murin $\rightarrow$ LAL-T}.
        \item Réduction de l'expression d'icTCR-β dans la pop DN dKO.
        \item Augmentation de l'expression de \alert{Notch1} relativement à thymus normal et notamment dans la pop DN.
      \end{itemize}
      \column{30mm}
      \includegraphics[width=40mm]{Images/dko_zfp_surv.png}
    \end{columns}
  
  \blfootnote{Hodson DJ, Janas ML, Galloway A, et al. Deletion of the RNA-binding proteins ZFP36L1 and ZFP36L2 leads to perturbed thymic development and T lymphoblastic leukemia. Nat Immunol. 2010;11(8):717-724}
  \blfootnote{Wang F, Qi Z, Yao Y, et al. Exploring the stage-specific roles of Tcf-1 in T cell development and malignancy at single-cell resolution. Cell Mol Immunol. 2021;18(3):644-659. doi:10.1038/s41423-020-00527-1}
\end{frame}

\begin{frame}[t]
  \frametitle{ZFP36L2 --- Bibliographie}
    \begin{itemize}
      \item L'\alert{hyperméthylation} d'un super enhancer de ZFP36L2 est observée dans les cancers squameux de l'oesophage ($\thicksim$1 kb en aval du 3’UTR).
      \item Des \alert{mutations récurrentes} de type fs ou ponctuelle ont été observées dans les LA. Jurkat = P190L, CEM et PEER = A329V. Ainsi que des délétions.
      \item Dans LT$_{\textrm{M}}$ liaison aux pre-ARNm notamment de INFg, TNF, Pim1 puis \alert{bloque la formation du complexe ribosomal} et la traduction. Lors de l'activation des LT$_{\textrm{M}}$ cette \alert{inhibition est rapidement levée} et permet une traduction importante.
    \end{itemize}
  \blfootnote{Lin, De-Chen et al. “Identification of distinct mutational patterns and new driver genes in oesophageal squamous cell carcinomas and adenocarcinomas.” Gut vol. 67,10 (2018): 1769-1779. doi:10.1136/gutjnl-2017-314607}
  \blfootnote{Iwanaga E, Nanri T, Mitsuya H, Asou N. Mutation in the RNA binding protein TIS11D/ZFP36L2 is associated with the pathogenesis of acute leukemia. Int J Oncol. 2011;38(1):25-31. }
  \blfootnote{Salerno F, Engels S, van den Biggelaar M, et al. Translational repression of pre-formed cytokine-encoding mRNA prevents chronic activation of memory T cells. Nat Immunol. 2018;19(8):828-837. doi:10.1038/s41590-018-0155-6}
\end{frame}

% \begin{frame}[standout]
%   \resizebox{0.2\linewidth}{!}{\itshape \emoji{woman-scientist}}
% \end{frame}

% \begin{frame}
%   \frametitle{Introduction}
%   \begin{figure}
%     \centering
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%   \end{figure}
% \end{frame}

\end{document}